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** 原文公众号：一起试验网
对下述分析方法感兴趣或者没有钻研思路的小伙伴，欢送踊跃探讨！**
早！明天小编和大家剖析一篇 2022 年 10 月发表在《Frontiers in Immunology》（IF:5.0）期刊上的文章《A necroptosis related prognostic model of pancreatic cancer based on single cell sequencing analysis and transcriptome analysis》。作者应用单细胞测序剖析和转录组剖析构建了胰腺癌坏死性凋亡相干特色。本钻研可为胰腺癌的诊断、医治及预后评估提供参考。该思路同样实用于其余肿瘤的钻研，有相干需要的老师欢送分割咱们。
背景 & 办法
背景：
胰腺癌（Pancreatic cancer, PCa）是影响人类衰弱最具侵略性的癌症之一。约 80-85% 的 PCa 患者在诊断时呈现不可切除状态或转移。承受手术切除的 PCa 患者的 5 年生存率仅为 10-25%。目前全身化疗是次要医治办法，但生存终局往往不现实。坏死性凋亡（Necroptosis）是一种新定义的程序性细胞死亡类型。一方面，坏死性凋亡是一种癌症克制因子，诱导癌细胞坏死性凋亡能够逆转其对细胞死亡的抵抗力。另一方面，坏死性凋亡被认为是癌症的促进剂。在此过程中开释的免疫活性物质和活性氧促成许多癌症通路的激活，参加免疫微环境的调节，促成肿瘤细胞的增殖和侵袭。因而，坏死性凋亡及其调控机制可能是 PCa 肿瘤免疫治疗的重要医治靶点。
办法：
1.GEO 和 TCGA 公共数据库获取 PCa 数据；
2.WGCNA 用于辨认与坏死性凋亡评分相干的模块；
3.Seurat 包用于单细胞数据分析；
4. 单因素和 LASSO 用于构建预后模型；
5.ESTIMATE 用于计算免疫和基质评分；ImmuneSubtypeClassifier 包用于计算
每个样本的免疫亚型；TIMER 2.0 用于剖析免疫细胞浸润；TIDE 数据库用于计算每个样本的 TIDE 评分，以评估免疫治疗的疗效；
6.MAfTools 用于渐变景观剖析；
7.Rms 用于构建列线图；
8. 基因敲低、CCK- 8 测定、菌落形成剖析、迁徙和侵袭测定以及伤口愈合细胞试验用于摸索要害基因 EPS8 的作用；
PCR 测定要害基因 EPS8 的表白。
钻研后果
（一）WGCNA 辨认与坏死性凋亡评分相干的模块
作者先通过 ssGSEA 计算每个样本的坏死性凋亡评分。并依据中位数分为高坏死性凋亡组和低坏死性凋亡组。而且，高坏死性凋亡组中 PCa 患者的坏死性凋亡评分较高，预后较差。将“坏死性凋亡评分”作为性状，并通过 WGCNA 辨认了与该评分显著相干的 ME 绿黄模块。
（二）单细胞测序剖析
本钻研中所纳入的样本间无显著批量效应。将所有细胞汇集成 14 个簇，依据每个簇的遗传特色，正文到 8 种细胞类型。而后确定每个细胞坏死性凋亡基因的百分比。依据中值，将细胞分为高 NCPTs 组和低 NCPTs 组。进一步鉴定了两组样本之间的 2518 个差别表白基因，而且，这些基因次要与 mRNA 代谢和蛋白质定位无关。
（三）TCGA 队列中预后模型的构建和评估
作者进一步将 ME 绿黄模块与 2518 个差别表白基因穿插，取得 805 个与预后相干的坏死性凋亡基因（Necrotic apoptosis gene）。通过单因素 Cox 剖析和 LASSO 构建预后模型。依据中位数把 TCGA-PCa 患者分为高 NCPTs_high 组和低 NCPTs_low 组，NCPTs_high 组患者预后较差。模型预测患者预后的 AUC 值显著优于年龄、性别分期等临床特色。决策曲线结果显示，患者从基于 NCPTS 的临床干涉中获益最多。而且，多因素 Cox 分析表明，NCPTS 是 PCa 患者的独立预后因素。此外，该模型能够很好地区分 NCPTS_high 组和 NCPTS_low 组患者。
（四）预后模型的内部验证和评估
为了验证预后模型，作者别离下载了 PA-AU 队列、PA-CA 队列和 GSE85916 作为内部验证。验证后果均与 TCGA-PCa 队列中的后果保持一致。
（五）免疫浸润剖析和 PCa 患者对免疫治疗反馈的应答
为了说明 PCa 预后与免疫微环境的关系，作者进一步剖析了 NCPTS_low 组和 NCPTS_high 组之间的免疫浸润景观。结果显示，与 NCPTS_high 组相比，NCPTS_low 组有较高的预计评分、免疫评分和基质评分，较低的肿瘤纯度。而且，NCPTS_low 组中有更高水平的免疫细胞浸润，如 T 细胞和 B 细胞等；另外，NCPTS_low 组中 ICPs 和 HLA 的表白也较高。
为了摸索模型中的基因是否可能领导 PCa 患者的分子分型，进一步进行无监督聚类分析，结果显示，与簇 1 相比，簇 2 的预后较差。随后，NCPTS 分组与簇以及免疫亚型之间的关系显示，簇 1 次要与 NCPTS_low 组无关，免疫亚型 C3 和 C6 次要散布在 NCPTS_low 组。簇 2 次要与 NCPTS_high 组相干，免疫亚型 C1 和 C2 次要散布在 NCPTS_ high 组。免疫亚型之间的生存剖析显示，免疫亚型 C3 组的预后最好，而 C3 次要散布在 NCPTS_low 组。总之，钻研结果表明，NCPTS_low 组的免疫细胞浸润程度较高，ICPs 和 HLA 的表白也较高，免疫亚型 C3 次要散布在该组。
另外，NCPTS_low 组的 TIDE 较低，表明肿瘤免疫逃逸的可能性较低，而患者免疫治疗获益的可能性较大。
（六）渐变景观剖析
鉴于基因突变在肿瘤的倒退和患者的预后中起着重要作用，进一步对 NCPTS_low 组和 NCPTS_high 组进行渐变景观剖析。两组患者最常产生渐变的前 5 个基因别离为 KRAS、TP53、SMAD4、CDKN2A 和 TTN。NCPTS_high 组 TMB 较高，而且 TMB 与 NCPTS 呈正相干（P<0.001）。TMB 通常与患者预后不良无关，这可能是 NCPTS_high 组预后不良的起因。另外，NCPTS_high 组激活了与细胞周期相干的 G2M_CHECKPOINT 和 E2F_TARGETS 通路。
（七）NCPTS 模型的临床意义
为了进一步钻研 NCPTS 在不同队列中的预后影响，随后进行了 meta 剖析。结果显示，NCPTS 依然是导致患者预后不良的一个因素。为了进一步促成临床胰腺癌患者的危险因素分类和治理，于是对 NCPTS 和临床特色进行了决策树剖析，患者被分为 RIS1、RIS2、RIS3 和 RIS4 个危险组。其中，RIS4 组预后较差（P < 0.001）。列线图中 TCGA-2J-AABK 患者的 1 年、3 年和 5 年死亡率别离为 18.5%、62.5% 和 75.2%，列线图预测的患者预后的 AUC 放弃在 0.8 左右，显著高于其余临床特色。基于列线图的患者及时承受临床医治的获益率高于其余临床特色。
（八）在 PCa 细胞系中验证要害基因 EPS8 的作用
最初，在细胞系中验证要害基因的作用。siEPS8- 3 在三种 siRNA 中体现出最高的敲低效率，因而被选作要害基因做进一步剖析。结果显示，在 CAPAN- 1 和 PANC- 1 细胞系中，EPS8 敲低后表白和细胞活性显著升高，细胞系产生集落的能力也显著升高，PCa 细胞的迁徙和侵袭能力也大大降低。伤口愈合试验显示，EPS8 组的迁徙能力在 si-EPS8 组中较弱。
（九）在临床 PCa 组织样本中验证 EPS8 的表白
与癌旁组织相比，要害基因 EPS8 在 PCa 肿瘤组织中显著上调。
