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文献介绍
文献题目 Whole-brain spatial organization of hippocampal single-neuron projectomes \
钻研团队 徐春、孙衍刚、龚辉、姚海珊、李澄宇、孙怡迪 \
钻研单位 中国科学院脑科学与智能技术卓越翻新核心 \
发表工夫 2024-02-02 \
发表期刊 Science \
影响因子 56.9 \
DOI 10.1126/science.adj9198
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摘要
绘制单个神经元投射对于了解海马体（HIP）的全脑连贯和不同性能至关重要。在这里，作者重建了 10,100 个小鼠 HIP 的单个神经元投射组，并分类了 43 个具备不同投射模式的投射组亚型。投射靶的数量和轴突尖端的散布取决于沿着 HIP 纵轴和横轴的胞体地位。许多投射组亚型在由空间转录组谱定义的特定 HIP 亚结构域中富集。此外，作者绘制了专门投射在 HIP 造成（HPF）内的 HIP 神经元以及投射到 HPF 内和 HPF 外靶的 HIP 神经的综合布线图。双半球投射神经元通常投射到一对具备同侧偏好的同源靶上。单神经元投射组的这些组织原理为了解 HIP 神经元的性能提供了构造根底。
钻研后果
1. HIP 神经元的投射组亚型分类
(A) 一张显示在胞体（上图）轴突树（底部图）中稠密表白 EGFP 的 HIP 切片的荧光图像。右侧的图像是左侧方框区域的高分辨率图像。比例尺：左侧，100 um；右侧，20 um。\
(B) 左图，所有绘制神经元的胞体散布（一个点等于一个神经元），并用示意图描述冠状切片中的 HIP 亚区。虚线示意 HIP 边界，实线是纵向 HIP 轴。D，背侧；V，腹侧；A，前侧；P，后侧。以雷同色彩编码 HIP 亚区和其中的神经元。右图，饼图显示各种 HIP 亚区中神经元数量及其投射组的绘制。\
(C) 顶部图，一个示例神经元显示轴突侧枝沿着尾侧（蓝色）和头侧（棕色）门路投射的。底部图，两个投射门路的示意图。\
(D) 热图显示单个 HIP 神经元在不同指标区域的轴突投射强度，头侧和尾侧门路的分支离开显示。所有神经元（每个垂直线一个）在 7 个 HIP 亚区（DG，CA3，CA2，CA1，SUB，ProS，SUBr）中按其胞体地位沿 D-V 轴排序，下方显示神经元数目。上游指标分为 9 个次要区域，即同侧和对侧 HPF，ISO，OLF，CTXsp，CNU，TH，HY，MB，显示在左侧（请参见 table S3 中所有缩写的全名）。投射强度由指标区域中的总轴突长度（以微米为单位）定义，并进行色彩编码（下方的彩条）。所有神经元在每个指标区域的均匀投射强度总结在最右侧的列中，针对两个门路之间的较大值进行归一化，并由点的大小编码。\
(E) 基于它们的轴突树模式对 HIP 投射组亚型进行的档次聚类（Ward’s method）。每个投射组亚型在 13 个指标区域的投射强度通过其最大长度进行归一化。依据它们对头侧或尾侧门路的不同偏好，对指标区域进行下标“R”和“C”的正文，如（D）所示。上图，从每个投射组亚型的所有神经元均匀的投射强度的热图。下图，胞体位于不同 HIP 亚区的神经元分数（黑白编码），体细胞沿 D-V 轴的密度散布曲线以及每个投射组亚型的总神经元数。\
(F-H) 示例神经元，group 1 中的 subtype 3（F），group 2 中的 subtype 26（G），group 3 中的 subtype 37（H）。指标区域内的轴突树以彩色显示。黑点示意胞体。
2. HIP 神经元的投射靶点依赖的胞体地位
(A) 上图，点图显示 50 个最常见的 extra-HPF 投射模式，热图显示在 intra-HPFc 指标区域总轴突树长度（依照轴突笼罩所有 intra-HPFc 指标区域总的轴突树长度进行归一化）。下图，下面所示的单个投射模式的神经元总数和胞体散布的密度散布。\
(B) 两个 HIP 神经元惟一优先靶向 LEC 或 MEC 的例子。黑点示意胞体。\
(C) 直方图显示了体现出不同水平的 LEC-MEC 选择性的神经元的数量（定义见资料和办法）。在最高（紫色）和最低（绿色）选择性 bins 中的神经元被认为是 LEC 和 MEC 选择性（sel.），各自地插入，LEC 和 MEC 选择性神经元中四个 HIP 亚区（CA1、SUB、ProS、SUBr）的神经元分数。\
(D) 所有 CA1 和 SUB 神经元向 LEC（紫色）和 MEC（绿色）选择性轴突投射沿 HIP D-V 轴胞体散布。沿 D-V 轴的细胞密度曲线和总结（mean ± SEM）显示在右侧。CA1 和 SUB 中的 LEC- 和 MEC- 选择性神经元。\
(E) 三种不同的投射模式 HIP 神经元的单细胞投射组的示例：RSP-only、MBO-only、RSP、MBO。RSP 和 MBO 内的轴突树枝别离用红色和橙色标记。黑点示意胞体。灰色线示意轴突树枝。虚线是纵轴。\
(F) 七种不同投射模式的 HIP 神经元的单细胞投射组的例子：NAc-only, mPFC-only, BA-only, NAc/mPFC, NAc/BA, mPFC/BA, NAc/mPFC/BA。不同靶区域内的轴突树枝用色彩标记：紫色为 NAc，绿色为 BA，蓝色为 mPFC。黑点示意胞体。灰色线，轴突乔木。灰色线示意轴突树枝。虚线是纵轴。\
(G) 左图，subtypes38、36、37 的神经元总数体现出 (E) 中所示的三种投射模式。这些神经元别离占 subtypes38、36、37 神经元的 31%、91% 和 98%。右图，总结了神经元沿 D-V 轴的胞体地位（mean ± SEM），左侧为三种投射模式。\
(H) (F) 中显示的 7 个投射模式的神经元沿 D-V 轴的胞体地位（mean ± SEM）。单个投射模式的神经元数如下：NAc/mPFC/BA 145、Nac 1160、mPFC 144、BA 108、NAc/mPFC 1866、NAc/BA 2137、mPFC/BA 316。沿 D-V 轴的 Nac-only 的投射神经元的均匀胞体地位上面的背景显示为绿色，下面显示为紫色。
3. 转录组与投射组亚型的空间相关性
(A) 示意图显示 Stereo-seq 数据采集和解决。将笼罩 HIP（bregma -0.9 to -4.4 mm）的薄切片（10 μm 厚）搁置在 Stereo-seq 芯片上用于 mRNA 收集，而后进行 RNA 测序和基因表白模式的聚类分析，如（B）中所示。\
(B) UMAP 图显示来自总共 23 个 HIP 切片的小鼠 CA1 亚区的单基因表白（top, Snap25 和 Plp1）和无监督的空间基因表白谱聚类（bottom）。每个点代表 Stereo-seq 芯片中一个 50 × 50 bin DNA 纳米球（直径 25 μm）的基因表白数据。基因表白谱的八个簇（圆圈）被辨认并用不同的色彩标记。\
(C) 顶部图，cluster 1 [C1, defined in (B)] 在不同 bregma 地位的四个代表性 HIP 局部中的空间散布。底部图，下面显示的四个代表性 HIP 切片中 C1 标记基因 Nnat 的表白谱。Nnat 的 mRNA 程度按如下所示的比例进行色彩编码。灰点是 C1 之外的空间 bin，绿线是 HIP 的边界。\
(D) 左图，UMAP 图通过对 C1 基因表白谱的进一步聚类显示了 C1 内的 14 个 subclusters。右图显示 14 个 subclusters 中标记基因的表白状况。\
(E) 热图显示了 Stereo-seq 切片的各个 bregma 地位发现的 C1 subclusters 的绝对频率，以及胞体位于雷同 bregma 地位的相应 CA1 投射组亚型。绝对频率由色标中编码的皮尔逊相关系数值示意。该图按相干值的聚类排序。神经元基因评分显示在右侧。\
(F and H) 基因表白谱（subcluster 总数的百分比）与各个相应 bregma 地位处的投射组亚型散布之间的空间对应关系。Spearman 相关性：subcluster 6 与投射组 subtype 39 (F)，P < 0.001；subcluster 8 与投射组 subtype 10 (H)，P < 0.0001。\
(G and I) 色彩编码图显示了投射组亚型（左）、subcluster 细胞密度（中）和基因表白（右）的 CA1 神经元的空间散布。(G) 投射组 subtype 39、subcluster 6 和 Snap25。(I) 投射组 subtype 10、subcluster 8 和 Gap43。\
(J to L) 点图显示 subclusters 2、5、6、7、8 中谷氨酸和 GABA 受体 (J)、乙酰胆碱受体 (K) 以及谷氨酸和 GABA 转运蛋白 (L) 亚基的基因表白。
4. HIP 中的双半球投射神经元
(A) 热图总结了每个投射组亚型中的神经元数量（通过投射到每对同源指标的神经元总数标准化），以及双边轴突投射到各种投射指标，包含 HIP (n = 803)、RHP (n = 533)、LSX (n = 806)、NAc (n = 55)、MSC (n = 140)、AON (n = 23)、TT (n = 17)、ATN (n = 85)、MBO (n = 1153)、LZ (n = 157) 和 PVR (n = 86)。\
(B) 显示六种亚型的单细胞投射组的示例，以及 LSX、NAc、MSC、AON、ATN、MBO 的双边投射。指标区域内的轴突树以色彩显示；其余是灰色。紫色点示意胞体。\
(C) CA1 神经元双边投射到 HIP 的示例。HIP 内的轴突树显示为蓝色；其余显示为灰色。洋红色点示意胞体。\
(D) 饼图显示 DG (5.6%)、CA1 (10.3%)、CA2 (2.7%)、CA3 (81.1%)、SUB (0.2%) 中双侧 HIP 投射神经元 (n = 803) 的百分比。\
(E) 沿 D-V 轴（左）的胞体密度散布以及两侧投射到 HIP 的 CA1（洋红色）和 CA3（蓝色）神经元的散布（右）。CA1 与 CA3 神经元的密度散布。\
(F) 左图，一个示例 SUBr 神经元双边投射到 RHP（例如 ENT）。RHP 中的轴突树显示为蓝色。右图，左侧显示同一神经元的 MEC 层中的轴突树。洋红色点示意胞体。比例尺，0.5 mm。\
(G) 饼图显示 CA1 (1.9%)、CA2 (0.4%)、CA3 (4.5%)、SUB (9.8%)、POST (20.6%)、PAR (17.6%)、PRE（43.5%）、ProS（1.3%）中双侧 RHP 投射神经元 (n = 533) 的百分比、和 HIP-amygdalar 过渡区（HATA，0.19%）。\
(H) 热图显示 LEC 和 MEC 不同层的轴突树长度，除了 (G) 中的 ProS 外，从 PAR、PRE、POST 收到了简直相等的双侧投射。树长度由每一层的最大树长度归一化，并在左边用刻度进行色彩编码。\
(I) 热图显示了双侧投射到 11 个脑区的神经元的数量，以及一个或几个额定的双侧指标（在列中）。每一行的双侧投射神经元的数量由这一行的最大值归一化，并以色彩编码（左边的刻度）。\
(J) 具备双侧轴突投射到不同指标的神经元的总结。顶部图，不同 HIP 亚区域中双侧投射神经元的总数（柱状图）和百分比（点大小）。底部图，小提琴图显示了同侧（左半局部，橙色）和对侧（右半局部，绿色）轴突的总长度，同一神经元的轴突长度只向同侧（左半局部，洋红色）和对侧（右半局部，蓝色）投射到 7 个次要指标：ISO、OLF、CTXsp、TH、HY、MB。\
(K) AON 中单个 HIP 神经元具备双侧轴突投射的 HIP 神经元的一个例子（树显示为棕色）。洋红色的点示意胞体。虚线示意大脑中线或 HIP 边界。\
(L) 箱线图显示了具备双侧轴突投射到不同靶区的神经元的同侧偏好指数。绿色的点是平均值，橙色的线是中位数。\
(M) 在所有投射到 11 个靶区域的神经元中，显示三种投射模式的神经元百分比：同侧（紫色）；对侧（绿色）和双侧（蓝色）。
5. CA1、SUB 和 SUBr 神经元的投射谱
(A) 顶部图，点图显示富集在 CA1、SUB、ProS、SUBr 区域的神经元的不同靶向模式（每个区域前 15 神经元数目）。底部图，条形图显示具备每种靶向模式的 CA1（洋红色）、SUB（紫色）、ProS（青色）、SUBr（橙色）神经元的百分比。\
(B) 左图，示意图显示基于独特投射指标数的轴突或接管该轴突输出的靶区的侧枝指数的定义。右图，具备投射到不同指标数量的 CA1（洋红色）、SUB（紫色）、ProS（青色）、SUBr（橙色）神经元的百分比。在 CA1、SUB、ProS、SUBr 子区域中的两组神经元之间进行卡方测验，并且所有的 P 值均小于 0.0001。\
(C) CA1（洋红色）、SUB（紫色）、ProS（青色）、SUBr（橙色）神经元在 13 个次要靶标区域中的单个轴突的侧枝指数的汇总（mean ± SEM），指标区域依照所有四组神经元的均匀轴突侧枝指数排序。\
(D to G) 顶部图，位于 CA1 (D)、SUB (E)、ProS (F)、SUBr (G) 区域的三个示例神经元（箭头）显示 OLF、CNU、CTXsp 通过尾侧通路（OLFC、CNUC、CTXspC）的共投射模式或 CNUc 和 CTXspc 的共投射模式。底部图，CA1（D）、SUB（E）、ProS（F）、SUBr（G）中的神经元轴突投射强度的不同指标对之间的皮尔逊相关系数（着色）。这 13 个指标区域是 HPFC、HPFR、ISOC、ISOR、OLFC、OLFR、CTXspC、CTXspR、CNUC、CNUR、THR、HYR、MBR，它们依照相关系数的档次聚类分析进行排序。实心正方形示意 CA1、SUB、ProS、SUBr 组的神经元共享的靶标模式；虚线正方形是特定于组的靶标模式。\
(H) HPF 内（顶部图）和 HPF 外（底部图）靶标中各子组（下方编号）中个体轴突的轴突长度聚类分析后的均匀总轴突长度的热图。首选的 HPF 内靶标在上方的红色框中标记。轴突长度别离通过在所有 HPF 内和 HPF 外靶标中找到的最大值进行归一化。两头图，CA1、SUB、ProS、SUBr 区域（着色）中具备胞体的神经元的比例及其沿 D-V 轴的散布。\
(I) 具备各种首选 HPF 内靶标的神经元的侧枝指数的汇总（mean ± SEM）：CA1（洋红色）、SUB（紫色）、ProS（青色）、SUBr（橙色）神经元。\
(J) 具备 LEC（顶部图，LEC 中的轴突显示为红色）和 MEC（底部图，MEC 中的轴突显示为绿色）作为首选 HPF 内靶标的两个神经元的示例，别离显示许多和大量的靶标。\
(K) 不同组的神经元之间在各种内 - 和外 -HPF 靶标对之间的轴突长度之间的皮尔逊相关系数。每行出现具备首选 HPF 内靶标的神经元子组的后果：CA、SUB、PRE、POST、ProS、LEC、MEC，如 (I) 所示。仅显示显著相关性，并进行着色编码。\
(L) 示例如下，插图显示了向一对内 - 和外 -HPF 靶标投射的轴突的神经元，显示了其在独特投射指标区域中轴突长度的正（具备雷同方向的箭头）和负（具备相同方向的箭头）相关性，对应于 (K) 中的实心正方形。顶部图，向 LEC 和 OLFR 发送轴突投射的两个神经元。底部图，向 CA 和 HYR 发送轴突投射的两个神经元。指标区域中的轴突树以色彩显示。
6. Schaffer 侧枝和 mossy 纤维轴突的纵向扩散
(A) 左图，一个示例 CA3 神经元向 CA3（蓝色）和 CA1（红色）发送轴突。彩色点示意胞体。右图，示意图显示在 HIP 区域（沿纵向轴上共 100 个 bin）的轴突树被投射到纵向轴上以计算纵向重量（l），并被投射到横向立体上以计算横向重量（t）。显示了计算 T、L 和 T-L 指数的方程式。\
(B) 一个背侧 CA3 神经元（顶部图）和一个腹侧 CA3 神经元（底部图）向 CA3 和 CA1 区域发送双侧轴突。彩色点示意细胞体。\
(C and D) 在沿纵向轴上的 100 个 bin 中剖析 T-L 指数。顶部图，线形图显示 CA3 神经元在背侧（蓝色，n = 352）和腹侧（橙色，n = 544）D-V 轴的均匀 T-L 指数。底部图，热图显示在每个 bin 中的 CA3 神经元轴突树的均匀 T-L 指数（着色），别离为同侧和对侧 CA3 区域（C）和 CA1 区域（D）。神经元按其胞体地位从背侧到腹侧排序。\
(E) 示例显示了沿 D-V 轴各处的五个 DG 神经元的 DG 区域（橙色）和 CA3 区域（蓝色）的轴突树。彩色点示意胞体。\
(F) 在沿纵向轴上的 100 个 bin 中剖析 T-L 指数。顶部图，沿 D-V 轴的背侧（蓝色，n = 741）和腹侧（橙色，n = 2318）DG 神经元的均匀 T-L 指数。底部，热图显示在每个 bin 中的 DG 神经元轴突树的均匀 T-L 指数（着色），别离为同侧 DG 区域和 CA3 区域。神经元按其胞体地位从背侧到腹侧排序。\
(G) 示意图阐明沿纵向和横向方向的 HIP 内轴突投射。左侧，背侧 HIP 中的一个 DG 神经元和一个 CA3 神经元。右侧，腹侧 HIP 中的一个 DG 神经元和一个 CA3 神经元。虚线示意横向立体。\
(H) 箱线图显示同侧和对侧 CA3 和 CA1 区域的背侧与腹侧 CA3 神经元的轴突树的 T-L 指数。\
(I) 箱线图显示同侧 DG 和 CA3 区域的背侧与腹侧 DG 神经元的轴突树的 T-L 指数。\
(J) 箱线图显示同侧和对侧 CA3 和 CA1 区域的轴突树笼罩的沿 D-V 轴的跨度范畴。\
(K) 箱线图显示同侧 DG 和 CA3 区域的轴突树笼罩的沿 D-V 轴的跨度范畴。
7. 轴突树散布与胞体横向地位的关系
(A) HIP 横截面的示意图，定义了 CA3 和 CA1 中的 P-D 轴以及垂直于 P-D 轴的 CA1 深度。\
(B and C) 单细胞投射示例，显示了在 300 mm 横截面 HIP 切片中的胞体（红点）、轴突树（白线）和轴突树末端（青点），叠加了 PI 染色图像。标记了 CA1 的 stratum（str.）层，包含金字塔层、方向层、喷射层和网状层 - 分子层（l-m）。(B) 两个 CA3 神经元的轴突树末端显示出对 CA1 深度的不同偏好。(C) 两个 CA3 神经元的轴突末端显示出在 CA1 的 P-D 轴上不同地位的偏好。\
(D and E) CA3 胞体沿 P-D 轴的地位与轴突末端在 P-D 轴上的地位的质心（D）和 CA1 的深度地位（E）的相关性（n = 765）。虚线示意线性回归。胞体的标准化纵向地位着色，右侧显示了比例尺。两个插图显示了在不同纵向地位的横截面上的相关系数（r）。箭头批示了在（C）和（B）中显示的横截面的纵向地位。\
(F) CA3 P-D 轴中胞体地位与 CA1 区域同侧和对侧轴突末端的深度和 P-D 地位之间的地形相干的示意图。\
(G) CA1 中胞体的空间散布（左）及其相应的 LEC 和 MEC 中的轴突末端（右）。胞体沿 P-D 轴的地位及其相应的轴突末端均以色彩编码，顶部显示了比例尺。箱线图显示了 LEC 和 MEC 中轴突末端地位的 NPC 之间的显著差别。\
(H) CA1 沿 P-D 轴的胞体地位与 ENT 中轴突末端地位的 NPC 之间的相关性（n = 1633）。虚线示意线性回归。\
(I) CA1 中胞体的空间散布及其相应的 EP 中轴突末端的示意图，出现形式相似于（G）。\
(J) CA1 沿 P-D 轴的胞体地位与 EP 中轴突末端地位的 NPC 之间的相关性（n = 160）。虚线示意线性回归。\
(K) 三个具备不同胞体地位沿 P-D 轴的 CA1 神经元的示例，投射到对侧 CA1，并在对称地位具备轴突树末端。点示意胞体。\
(L) 所有 CA1 到 CA1 对侧投射神经元（n = 89）的汇总，显示了 CA1 沿 P-D 轴的胞体地位与对侧 CA1 区域沿 P-D 轴的轴突末端地位的质心之间的相关性。\
(M) 条形图总结了各上游区域的相关系数，在这些区域中，CA1 神经元沿 P-D 轴的胞体地位与轴突末端地位的标准化主重量显著相干。M，两头。L，侧面。
8. 依赖于胞体沿纵向地位的轴突树散布
(A) 示例显示具备不同纵向胞体地位（背侧和腹侧）的两个 CA1 神经元，在不同的 MEC 区域体现出轴突树化景象。黑点示意胞体。\
(B) HIP 神经元胞体的空间散布（左）及其在 LEC 和 MEC 中相应轴突树末端的地形（右）。胞体沿 D-V 轴的地位及其相应的轴突树末端以色彩编码，两头显示了比例尺。\
(C) HIP 神经元胞体沿 D-V 轴的地位与 ENT 中轴突末端地位的 NPC 之间的相关性 [与 (B) 中的雷同色彩编码；Pearson 相关系数，r = 0.80，P < 0.0001，n = 3177 个神经元]。\
(D) 热图总结了沿 D-V 轴的七个 HIP 亚区的神经元胞体地位与各上游区域的轴突末端地位的相关性系数（以色彩编码）。仅显示显著相关系数。\
(E) CA1、SUB、ProS、SUBr 中神经元的次要靶标数量与胞体沿 D-V 轴的散布（示意为纵向跨度）之间的相关性。\
(F) CA1、SUB、ProS、SUBr 中神经元的次要靶标数量（mean ± SEM）与其胞体沿 D-V 轴的地位之间的相关性。\
(G) 示意图阐明了具备纵向胞体地位（D-V 轴上的八个 bin）的七个 HIP 亚区中的神经元投射到次要靶标内各上游区域的数量：同侧和对侧 HPF、ISO、OLF、CTXsp、CNU、TH、HY、MB。对于每个上游靶标，每个 bin 中的 HIP 神经元数都通过了投射到该靶标的最大神经元数的归一化解决。
总结
通过将 fMOST 技术与单个轴突示踪程序联合，作者在微米分辨率下绘制了整个 HIP 的 10,100 个单神经元投射组，并创立了一个全面的三维单细胞图谱，包含 HIP 神经元的胞体、树突和轴突树沿纵向和横向轴的散布，以及 CA1 区域的空间转录组图谱。投射组和转录组数据均在线可视化（https://mouse.digital-brain.cn/hipp）。该钻研揭示了以下发现：（i）具备特定模式的 43 种投射组亚型，其外部和内部 HPF 投射靶标的投射靶向模式；（ii）轴突投射专门用于外部 HPF、皮层或亚皮层区域，或这些区域的组合；（iii）靶向模式相干的选择性纵向亚域的优先胞体地位；（iv）向繁多一对同源靶标的双侧投射；以及（v）轴突树在靶区的散布与胞体在纵向和横向轴上的地位之间的地形相关性。这些发现提供了无关单细胞分辨率下 HIP 神经元整个大脑连贯模式的前所未有的信息。
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